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細(xì)胞凍存、復(fù)蘇策略

一般來(lái)說(shuō)，細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)移，的策略是進(jìn)行低溫保存（-70℃~-196℃），而細(xì)胞深低溫保存的基本原理是：在-70℃以下時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的酶活性均已停止，即代謝處于*停止?fàn)顟B(tài)，故而可以*保存。細(xì)胞低溫保存的關(guān)鍵，在于通過(guò)0~20℃階段的處理過(guò)程，在此溫度范圍內(nèi)，冰晶呈針狀，極易招致細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷。

經(jīng)過(guò)前人的*試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的凍存及復(fù)蘇基本原則是慢凍快融，這樣科研zui大限度的保存細(xì)胞活力。

一、材料準(zhǔn)備

1、儀器：凈化工作臺(tái)、離心機(jī)、恒溫水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差顯微鏡、培養(yǎng)箱、液氮冰箱。

2、玻璃器皿：吸管（彎頭、直頭）、培養(yǎng)瓶、玻璃瓶（250ml、100ml）、廢液缸。

3、塑料器皿：吸頭、槍頭、膠塞、移液管（10ml）、15ml離心管、凍存管（1~2ml）。

4、其他物品：微量加樣槍、紅血球計(jì)數(shù)板、記號(hào)筆、*、移液槍。

5.PBS,胎牛血清，DMSO，培養(yǎng)液，雙抗，*（0.25%）

二、細(xì)胞凍存

目前細(xì)胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護(hù)劑，這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由冰晶形成的細(xì)胞損傷。

1、10%的DMSO+90%胎牛血清。甘油一般用于菌種保存很少用于細(xì)胞凍存。

2、取對(duì)數(shù)生*的細(xì)胞，用*把單層生長(zhǎng)的細(xì)胞消化下來(lái)，懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞則直接將細(xì)胞移至15ml離心管中。

3、離心1000 rpm,5 min.

4、去除*及舊的培養(yǎng)液，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中細(xì)胞的zui終密度為5x10^6/ml~1x10^7/ml.

5、 在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱，凍存時(shí)間及操作者。

6、 凍存：標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序?yàn)榻禍厮俾?1~-2℃/min；當(dāng)溫度達(dá)到-25℃以下時(shí)，可增至-5℃~-10℃/min；到-100℃時(shí)，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細(xì)胞的凍存管放入-20℃冰箱2h，然后放入-70℃冰箱中過(guò)夜，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi)。

三、細(xì)胞復(fù)蘇

1、從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃溫水中，并不時(shí)搖動(dòng)令其盡快融化。

2、從37℃水浴中取出凍存管，打開(kāi)蓋子，用吸管吸出細(xì)胞懸液，加到離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液，混勻。

3、離心，1000 rpm，5 min。

4、棄去上層清液，加入含10%小牛血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，接種培養(yǎng)瓶，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。

5、次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。